两步，做出强迫症都满意的 qPCR 曲线

最近常在实验室看见闷头处理数据的小师妹，跟霜打了的茄子一样。询问缘由，发现是 RT-qPCR，实验进展不顺利。

师妹

师兄，我的 qPCR 曲线和文献上长得不一样！

出现什么问题了？

师兄

师妹

我的 NTC 样本也有扩增，好奇怪啊!

你做了熔解曲线没有?

师兄

师妹

有做熔解曲线，师兄你看，怎么左边还有其他峰?

应该是出现了引物二聚体和污染，今天我们就来看看怎么避免它们。

师兄

引物二聚体为何出现？

小师妹碰到的引物二聚体问题，是 RT-qPCR 实验中最常见的问题之一。其原因是引物对之间的部分序列存在同源性。

怎么判断自己的 RT-qPCR 出现了引物二聚体？可以用熔解曲线来完成验证。

熔解曲线，是结合染料的双链 DNA 解离或「熔解」成单链 DNA 时，观察到的荧光强度的变化，比如小师妹做的这张图：

（图源：作者提供）

如果扩增特异性良好，则解离曲线将出现一个较窄的单峰。而引物二聚体的荧光强度较低，呈「较宽较低」的波形，见师妹熔解曲线图中 75°C 位置的高峰。

NTC 扩增又是怎么一回事？

NTC 是指无模板对照——即用水代替荧光定量 PCR 反应中的核酸。其他的试剂按比例正常加入，用于监测反应体系中的污染。

正常情况下，NTC 孔中不会有扩增。当 NTC 孔出现扩增时，则预示体系中可能有污染。

（图源：作者提供）

怎么解决引物二聚体？

最好在引物设计阶段就能采取简单的预防措施，从一开始即避免二聚体的形成。

今天给大家列举了 5 种常见方法，解决引物二聚体：

（图源：作者提供）

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作者｜多伦多大学 postdoc 木兰

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