近日，Nucleic acids research（IF=19.160）在线发表了由复旦大学戚继研究员团队和江西农业大学国春策教授团队合作完成的研究论文“A spatiotemporal atlas of organogenesis in the development of orchid flowers”。本研究应用10x Visium空间转录组技术对兰科植物蝴蝶兰（Phalaenopsis Big Chili）的花器官的发育过程进行了研究。通过分析数千个与花发育相关基因的空间表达分布，高分辨率地识别了兰花早期发育的多种细胞类型。百迈客有幸参与此项研究工作，为该研究提供了空间转录组测序服务。
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研究背景
花器官的发育是被子植物中特有的一个神秘过程，涉及到细胞在特定位点的生长、分裂和分化以及细胞与细胞之间的相互作用等一系列细胞活动。典型的高等植物花器官一般可以分为四轮结构,从外向内依次是萼片、花瓣、雄蕊和心皮。而控制花的四轮结构发育的就是典型的“ABC”模型，MADS-box基因在其中起着非常重要的作用。
兰科是被子植物中最大的科之一，有763属，28,000多个种，被认为是研究花器官发育和进化的模式科。然而，对兰花花发育复杂过程的全面认识还远远不够，特别是缺乏对其器官发生关键调控网络的时空研究。
研究思路
研究结果
1、兰花花器官早期发育的空间转录组测序和细胞类型识别
为了提供花器官发生的时空细胞图谱，以便全面理解器官发生的复杂过程，本研究在10× Visium平台上对蝴蝶兰(P. Big Chili)三个总状花序组织样本的矢状面进行了空间转录组测序，从时期上覆盖了花序分生组织存在到接近成熟的花器官的大部分早期发育阶段（图1A）。研究团队利用自主开发的STEEL算法，将空间转录组数据清晰地分为40个clusters（图1B、C）。其中，花被片、唇瓣和花柱组织中的beads聚类性较好，且与相应的组织形态学检测的观察结果高度一致。 总之，三张切片的空间转录组共检测到14,328个基因的表达，其中有3,817个基因被鉴定为特异性或优先在一个或多个组织中表达，为后续详细分析从分生组织细胞到分化后细胞的细胞类型变化提供了分子图谱。
图1 基于空间转录组学的兰花早期发育阶段器官发生的重建
2.早期花原基存在分生组织细胞，随后分化为营养型细胞和生殖细胞
为了研究从分生组织细胞到营养型细胞(花被、唇瓣)和生殖细胞(花柱)的分化，研究团队用Monocle绘制了细胞状态的轨迹。如图2B所示，三簇分生组织细胞形成了一条连续的路径，代表其发育过程，与其在组织学切片上的位置高度一致。该路径分为两条子路径：一条是由花被片中的营养型细胞组成，另一条由花柱中的花药原基生殖细胞组成。细胞类型变化的轨迹作为动态发育过程的静态投影，也可以理解为分生组织细胞的拟时序分化。如图2C所示，此时营养型细胞出现较早，并分散在子路径的远端。共鉴定出4,685个空间差异基因与发育拟时间相关，对这些基因绘制分支轨迹基因表达热图，发现它们随着发育路径的分离表现出不同的表达模式（图2D）。MapMan功能富集图显示它们主要富集在细胞壁代谢、激素、脂质、蛋白质和RNA合成等功能上（图2E）。通过基因的拟时分布图发现许多其他基因可能在分生组织、营养组织和生殖组织的细胞分化过程中发挥作用(图2F)。
图2 分生组织细胞向营养型细胞和生殖细胞的分化
3.MADS-box基因的空间表达分布说明了决定兰花花部器官的ABC code
为了发现兰花中特异的ABC code，本研究对7种被子植物的MADS-box基因进行了系统发育分析。在蝴蝶兰中的21个ABCDEG类MADS-box基因中，有15个基因在空间转录组数据集上检测到表达信号，且在不同组织部位呈现出优先或特异的表达模式（图3）。其中，AP3-like和PI-like基因(B类基因)均在花被片、唇瓣和花柱的原基中表达。特别是PAXXG070630在花柱顶端组织周围表现出梯度表达信号，其中单个spot点表达量最高，其周围细胞的表达信号随着离中心spot点的距离增大而减弱，表明花药在发育的这一阶段是从单个spot点开始的。AG-like（C类基因）的空间表达谱上也存在类似的情况，为花药的器官发生提供了进一步的证据。而AP1-like基因（A类基因）优先表达于分生组织中或广泛表达于各器官中，AGL6-like（G类基因）则在唇瓣和花被片中特异表达。
图3 15个MADS-box基因的空间表达分布图
4.持续激活的分生组织细胞群参与花被片的形成
通过对被片细胞进行发育轨迹分析，发现5号花苞被片细胞处于发育轨迹最远端，基因表达呈现出高度一致性。而6号花苞被片细胞由4个亚群组成,显示出细胞之间的高度异质性。如图4A所示，发育轨迹分析显示，发育起始于基部分生组织细胞（cluster22、cluster27），然后路径分散为在近期分化(cluster1)和早期分化(cluster2)的被片细胞。拟时序分析表明细胞状态从分生组织到近期分化细胞再到早期分化细胞的持续变化(图4B、C)。通过对6号花苞分生组织细胞群和分化早期、近期的被片细胞群中检测到的987个基因，绘制分支轨迹基因表达热图，发现它们的表达水平与组织部位呈现高度相关性（图4D）。分生组织、被片组织优先表达的基因显著富集在蛋白质合成、光合作用和细胞壁合成等相关途径上（图4E）。
图4 切片1中6号花苞的分生组织细胞向花被片细胞分化的分析
5.花药发育的起始和随后多种细胞类型的分化
与花被、唇瓣这类营养组织不同，花药的发育起始时间更晚，过程也更为复杂。花药起始于花柱顶端的花药原基，如图2A所示，spot点中B-和C-功能基因表达呈现高表达。与此同时，许多下游基因被激活，用于进一步的形态建成过程。例如，在6号花苞的花药中心出现花粉块，之后在7号和8号花苞中可以观察到它的形状变化过程（图5A）。为了进一步探究花药发育过程中基因表达的动态变化，收集了花药原基或花粉上优先表达的1,683个基因进行比较，发现不同花苞之间存在不同的表达模式。正如如图5B所示，在5号花苞和8号花苞中分别有123和141个基因高表达。而其中大部分基因呈现从5号花苞到8号花苞整体减少的表达模式。展示了与兰花生殖相关营养型细胞中特异表达或优先表达的一系列关键基因，显示了花药发育过程中表达谱的动态变化。通过对三个样本的120个clusters进行PCA分析，表明花药的早期营养组织，虽然存在相似的基因表达模式，没有表现出特异表达的基因，但在发育后期迅速经历了分化和形态建成过程（图5C）。
图5 花药多发育阶段的身份决定与形态建成
总 结
本研究利用10x Visium空间转录组学数据分析了蝴蝶兰花器官早期发育过程中基因表达的动态变化。通过对时空表达分布的比较，确定了在特定组织/阶段优先表达的数千个基因，包括著名的MADS-box基因和许多其他潜在下游基因，形成了花器官初始化、身份决定和形态建成的模型。对兰花开花发育过程进行了系统的研究，为进一步研究兰花开花过程中复杂而重要的基因调控网络提供了宝贵的资源。
项目经验
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参考文献
Liu C, Leng J, Li Y, Ge T, Li J, Chen Y, Guo C, Qi J. A spatiotemporal atlas of organogenesis in the development of orchid flowers. Nucleic Acids Res. 2022 Sep 12:gkac773.