作为一种新型的细胞免疫疗法，CAR-T 细胞疗法如今已经成为肿瘤治疗的新“风口”，相较于传统的手术治疗以及放/化疗，CAR-T 疗法在淋巴瘤、白血病等血液肿瘤的治疗中表现出较好的临床效果，商业化进展也较为迅速。2017 年，诺华开发的 Kymriah 获批上市拉开了 CAR-T 疗法商业化的时代序幕。
虽然在血液肿瘤中的疗效积极，但 CAR-T 细胞治疗实体肿瘤的表现并不理想，其中，T 细胞耗竭是以 CAR-T 为代表的 T 细胞免疫疗法攻克实体肿瘤所面临的主要障碍之一，探索和理解 T 细胞耗竭的过程和机制是破解 CAR-T 对抗实体肿瘤的关键。
（来源：Cancer Cell）
近日，中国科学院动物研究所王皓毅课题组发布了一项新研究成果，揭示了敲除 BATF 在提升 CAR-T 细胞抗耗竭能力的同时还能促进产生大量中央记忆 T 细胞进而提高 CAR-T 对于实体肿瘤的治疗效果。目前，这项研究已经以“Depletion of BATF in CAR-T cells enhances antitumor activity by inducing resistance against exhaustion and formation of central memory cells”（BATF缺失的CAR-T 细胞通过诱导抗耗竭和形成中央记忆细胞增强抗肿瘤活性）为题发表在 Cancer Cell 上。
“我们通过不同的试验条件发现，BATF 转录调控因子在 CAR-T 细胞耗竭过程中发挥不同的作用。其中，在能够发生 T 细胞产生耗竭的试验条件下，BATF 会促进耗竭过程，因此，敲除 BATF 能够提高 CAR-T 细胞的抗耗竭能力进而产生更为持久和高效的抗肿瘤效果。”中国科学院动物研究所研究员王皓毅教授告诉生辉。
▲图｜中国科学院动物研究所研究员王皓毅（来源：受访者）
王皓毅本科毕业于厦门大学生物系，2009 年在圣路易斯华盛顿大学获得分子细胞生物学博士学位，随后他进入麻省理工学院 Whitehead Institute 从事博士后研究工作，研究方向主要围绕基因编辑和干细胞领域。2014 年，王皓毅回国并进入中国科学院动物研究所担任研究员，研究方向包括 T 细胞与人类多能干细胞的应用开发以及研发源头创新的基因编辑工具等。截至目前，他已经在 Cell、Nature Biotechnology、Cell Stem Cell、Cell Research 等期刊发表 60 余篇研究论文，获得技术专利近 10 项。
BATF 具有多重功效，既能促进细胞增殖也可加速细胞耗竭
先前的研究发现，在 CAR-T 细胞对抗肿瘤细胞时，若 T 细胞无法将肿瘤细胞消灭，那么就会被肿瘤抗原持续激活，进而陷入到一种“耗竭”状态，这是 CAR-T 细胞疗法治疗实体肿瘤的一大挑战。
很多研究人员也曾针对肿瘤组织浸润的 T 细胞进行单细胞测序来探究整个耗竭过程，并揭示了一些与耗竭相关的基因和通路，但问题在于这些肿瘤浸润 T 细胞异质性高且很难作为研究模型对其进行直接操作。
“所以，建立一个能够模拟 T 细胞耗竭状态的体外模型是至关重要的。”王皓毅表示，“这项研究工作最初并不是围绕 BATF 开展的，而是如何构建一个能够在体外模拟 T 细胞的耗竭过程和状态的模型，以及通过对模型进行遗传操作来探索相关基因和通路是否发挥作用。”他说道。
在这项研究中，王皓毅课题组通过调控肿瘤细胞和 CAR-T 的共培养条件，在体外成功构建出 CAR-T 细胞耗竭模型。“模型构建完成之后，我们首先对其进行了分子鉴定，证明了该模型跟已经报道的肿瘤患者体内的耗竭 T 细胞非常类似。”他说道。
随后，他们基于该模型确定了 30 余个基因进行基因筛选，探索调控何种基因可以延缓或阻止 CAR-T 细胞耗竭的发生。“我们发现，对 BATF 基因进行敲除能够减缓 CAR-T 细胞的耗竭进程。”王皓毅指出，“于是，我们针对 BATF 开展了功能探索，发现 BATF 结合在耗竭相关基因位点以及与中央记忆 T 细胞形成的相关基因位点上，同时，BATF 的敲除可以降低耗竭相关基因的表达，而 BATF 的过表达可以促进耗竭相关基因表达。这也就意味着，BATF 是通过直接结合在耗竭相关基因位点来加剧 CAR-T 细胞耗竭。”
“在我们论文审稿期间，Nature Immunology 发表的一篇研究论文指出 BATF 能够阻止 CAR-T 细胞耗竭，而我们当时得出的结论是 BATF 能够促进 CAR-T 细胞耗竭，两项研究得出的结论截然相反，于是，我们继续开展了更为深入和详细的试验探索。”王皓毅说道。
他们在不同的耗竭诱导条件下，在 6 种人类不同 CAR-T 细胞和小鼠 OT-1 T 细胞中进行 BATF 敲除与过表达，发现 BATF 功能是多方面的，既能促进 T 细胞的增殖，也能促进 T 细胞的耗竭。
▲图｜BATF 在 CAR-T 细胞耗竭条件下的作用（来源：Cancer Cell）
据介绍，在较高的效靶比试验条件下，比如 1 个 CAR-T 细胞对抗 1 个肿瘤细胞，CAR-T 细胞能够快速杀灭肿瘤细胞，此时如果过表达 BATF 则可以帮助 CAR-T 细胞更好的增殖并发挥作用，所以这种条件下得出的结论为 BATF 是抗耗竭的；在比较低的效靶比试验条件下，比如 1 个 CAR-T 细胞对抗 100 个肿瘤细胞，这种情况下，BATF 所起的主要作用是促进 CAR-T 细胞耗竭。
“这项研究通过多种细胞类型与试验条件进行了更为全面和详细的探究，揭示了先前的研究出现两种截然相反的结论，主要是由于不同的试验条件所致。”王皓毅指出，“而我们在一个能够确保 CAR-T 细胞产生耗竭的试验条件下，因此得出的结论是 BATF 的功能更多的是通过直接上调耗竭相关基因而促进耗竭的过程。”
在王皓毅看来，在体外模型中对 BATF 开展试验的时候容易产生“盲人摸象”的结果，既在一种特定的试验条件下只看到其中一方面的功能，进而产生一个相对片面的结论。“BATF 本身是转录调控因子，调控上千个基因的表达和变化，因此它的功能是多方面的，既能促进 T 细胞增殖，同时又能促进 T 细胞的耗竭并抑制中央记忆 T 细胞的形成，所以更全面的表述应该是 BATF 负责平衡 T 细胞的免疫状态。”他指出。
率先开展异体 CAR-T 研究，先前的科研成果已进行产业转化
谈及下一步的研究动向，王皓毅表示，基于这种 T 细胞耗竭模型，除了可以进行基因研究，比如进行更高通量的基因筛选，也可以进行药物筛选，比如直接筛选到缓解或者恢复 T 细胞功能的小分子。“我们希望能够筛选到一些可以恢复 T 细胞功能的小分子药物，达到与抗 PD-1/PD-L1 抗体相当的治疗效果，此外，我们也希望能够筛选到不依赖于 PD-1/PD-L1 发挥功能的小分子药物，将这些药物与抗 PD-1 抗体联用或许能够更好地治疗肿瘤。”他说道。
据介绍，在成药性方面，除了针对 BATF 之外，王皓毅实验室还发现了多个对于 T 细胞耗竭影响较大的潜在治疗靶点，现阶段正在进行对于实体肿瘤治疗效果评价。“如果能够结合一些不同的重要通路可能会大幅提升 CAR-T 细胞对于实体肿瘤的治疗效果。”他指出。
在王皓毅看来，目前 CAR-T 细胞疗法所面临的局限性主要体现在适应症、可及性等方面。“其中，现阶段面临的最大的挑战是对于实体瘤的治疗效果。毕竟，在肿瘤类型中实体肿瘤占据 90% 以上，CAR-T 细胞疗法只有攻克了实体肿瘤才能够惠及更多的患者。”他说道。“而降低 CAR-T 成本则有多种技术路线，包括现在比较热门的通过人多能干细胞来分化 T 细胞的方式。”
对于 CAR-T 细胞疗法的未来发展趋势，王皓毅表示，“通用型 CAR-T 细胞疗法是一大趋势，而我们实验室是国内最早开展多基因编辑、具有通用型潜力的 CAR-T 细胞研究团队之一。”使用异体 T 细胞制备通用型 CAR-T 细胞治疗多名患者，安全性是第一位的，既要确保过继细胞不能攻击患者自身细胞，同时也要降低其免疫原性避免宿主细胞攻击。
▲图｜利用 CRISPR-Cas9 实现在 CAR-T 细胞中的多基因编辑（来源：Cell Research）
据介绍，早在 2016 年，王皓毅课题组便在 Cell Research 发表了题为“CRISPR-Cas9-mediated multiplex gene editing in CAR-T cells”的论文，展示了利用 CRISPR-Cas9 敲除 B2M、TRAC、PDCD1，开发出“三基因敲除”、具有通用型潜力 CAR-T 细胞的方法。
在这项研究中，他们利用 CRISPR-Cas9 将 αβT-cell receptor（TCR）从异体 CAR-T 细胞中敲除以避免移植物抗宿主病的发生，同时将人类白细胞抗原（HLA）敲除以降低自身的免疫原性，另外，考虑到阻断 PD-1 信号通路在许多肿瘤类型中都取得了较好的疗效，所以他们也在 CAR-T 细胞中敲除了 PDCD1 基因来阻断 PD-1 信号通路。最终，他们借助 CRISPR-Cas9 对多基因同时进行编辑成功制备出异体 CAR-T 细胞，并通过试验发现这种异体 CAR-T 细胞在体外及体内具有更强的肿瘤细胞杀伤效果。
“总结起来，我认为 CAR-T 的发展主要围绕两大方向，其一，利用自体的 CAR-T 细胞治疗实体肿瘤；其二，基于目前治疗血液肿瘤效果较好的 CAR-T 建立通用型异体 CAR-T 疗法，只有自体 CAR-T 实现突破之后，下一步才是采用通用型异体 CAR-T 治疗实体肿瘤。”王皓毅说道。
据介绍，王皓毅课题组现阶段的研究方向主要围绕两方面，一方面侧重于基因编辑工具的应用，另一方面侧重于源头创新基因编辑工具的开发。“具体而言，我们通过在 T 细胞中建立并进行高通量遗传学和小分子筛选技术，以期为免疫治疗发现新的治疗靶点和药物。”他介绍说，“此外，ZFN、TALEN 和 CRISPR 等技术的工具酶大都来自于不同物种功能基因研究，我们希望通过生物信息学分析找到可能成为基因工程技术新工具的候选酶，利用体内和体外的高通量功能检测平台筛选出具有新功能或更优特性的工具酶，进而建立新型的基因组改造技术。”
谈及产业转化方面，在王皓毅看来，做科研不只是为了发表论文，而是希望未来能够应用到临床，去真正解决临床问题，造福更多患者。“我们已经把一些先前的研究成果进行了转化，主要是面向 CAR-T 细胞疗法公司，目前我们正在开展合作进行临床细胞制备工艺的提升以及 IIT 研究。”王皓毅介绍道。