平衡易位（BRT）是一种常见的染色体结构重排（SR），由非同源染色体的两个末端片段互换引起。BRT携带者通常表型正常，因为整体染色体保持不变，绝大多数断点出现在非重复区域。但BRT在约5%的病例中与多种临床疾病相关。与正常个体相比，由于产生正常或平衡配子的机会较差，BRT携带者不孕、复发性流产或后代出生缺陷的风险增加。
胚胎植入前基因检测（PGT）技术已广泛用于鉴定BRT携带者的二倍体胚胎。通过选择性移植正常的二倍体胚胎，携带者可以避免因复发性流产或终止妊娠。目前已有数种方法用于区分胚胎是否携带BRT，包括荧光原位杂交（FISH）、单核苷酸多态性（SNP）阵列、阵列比较基因组杂交（aCGH）和下一代测序（NGS）。但FISH方法仅限于检测几种特定的染色体，由于荧光探针的光信号不明确和样本制备过程复杂，检测结果不确定性相对较高。
近日，中南大学湘雅医院及中南大学生命科学学院、亿康医学等团队利用纳米孔测序区分了PGT-SR周期中的BRT携带者，检测结果与MaReCs检测结果一致，并通过羊膜细胞的核型分析得到进一步证实。研究团队通过纳米孔测序成功地识别了平衡易位断点，测定精度为单个碱基对。该研究表明，纳米孔测序可以作为识别BRT携带者平衡二倍体胚胎状态的临床检查策略之一。相关研究结果发表BMC Genomics上，文章题为“Nanopore sequencing for detecting reciprocal translocation carrier status in preimplantation genetic testing”。
纳米孔测序是一种单分子长读长测序技术，可提供较长的读取长度，大大增加了精确识别易位断点的机会。其次，纳米孔测序可以处理更复杂的易位变异，尤其有助于识别位于重复和GC偏向区域的断点。第三，该技术有助于定位与易位相关的SNP单倍型，这对于在PGT-SR周期中鉴定非携带者胚胎至关重要。与其他方法相比，纳米孔测序需要更少的时间和成本。更重要的是，在PGT-SR周期开始之前，使用纳米孔测序可以在BRT携带者外周血的基因组DNA中识别易位断点。研究团队认为，这些优势将允许纳米孔测序用于预防PGT周期中的复发性流产，未来或可在大多数PGT中心可用。
研究团队首先使用MaReCs来区分了具有正常核型的胚胎与具有平衡染色体倍体的易位载体胚胎。从携带BRT基因的亲本遗传到一条以上不平衡染色体的胚胎被认为是参考胚胎。在患者1中，研究人员对11个胚胎（A-K）进行了染色体分析。其中胚胎C、D、E和J表现出正常的倍性（图1），胚胎B、F、G、H和K携带异常的2号和5号染色体，并被用作鉴定易位断点的参考胚胎。对来自患者2的12个胚胎，在其中4个胚胎中证实了整倍性：A、B、C和L，并成功鉴定出5个13号和17号染色体异常的参考胚胎（D、E、G、H和I），用作鉴定易位断点的参考胚胎。研究还观察到两个胚胎（F和J）具有其他异常染色体，在胚胎K中检测到单倍体10q嵌合。
图1.患者1（上）和患者2（下）的胚胎染色体倍体结果（A-F）。
随后，研究团队对相关胚胎和亲本中易位断点两侧的SNP进行测序。对两个家系进行了SNP单倍型检测，绘制了与携带易位染色体和正常染色体相关的单倍型（图2）。来自患者1的三个整倍体胚胎没有易位断点，在患者2中鉴定出两个相似的胚胎。总的来说，研究团队使用MaReCs成功地识别了两个家系的易位断点，从而能够将平衡的无易位胚胎转移给患者。
图2.纳米孔测序确定患者1（上）和患者2（下）胚胎的携带者状态。
TGS是在PromethION 48上进行的。研究团队分析了从PromethION 48中获得的纳米孔测序数据（患者1的101Gb数据和患者2的103Gb数据），并成功识别了两例患者的易位断点（图3）。在患者1中，断点位于chr2:125,157,514和chr5:35,465,883，在患者2中，断点位于chr13:26,208,296和chr17:33,942,282，这与MaReCs检测结果一致。此外，利用纳米孔测序数据构建的SNP单倍型与MaReCs获得的SNP单倍型一致。以上发现表明，纳米孔测序可以准确识别易位断点，可用于区分PGT-SR周期中无易位胚胎与平衡二倍体胚胎。
图3.患者1（上）和患者2（下）易位断点的纳米孔测序图谱。
易位断点识别是PGT-SR中的一个挑战，目前已经建立了多种方法将断点映射到千碱基水平。但这些方法通常耗时长，难以在人群中广泛应用。在这项研究中，MaReCs可在千碱基水平（约200 kb）识别易位断点，而纳米孔测序可将易位断点映射到更高分辨率，即在单碱基水平上。以上结果表明，长reads（纳米孔测序）在易位断点检测方面优于短reads （NGS），这一发现在阻断人群易位繁殖方面具有广阔的临床应用前景。
同时，纳米孔测序仍有一定的局限性。例如，高分子量基因组DNA对于纳米孔测序产生长读长至关重要，但大多数PGT中心采用的方法往往更适合短读长测序。此外，由于PGT中心通常倾向于使用传统的离心柱进行基因组DNA提取，因此很难达到2µg DNA的总量。获取足够基因组DNA量所需的大量外周血样本对于PGT中心来说也是一个挑战。此外，相比于长读长测序技术，短读长测序的成本一直在下降。
该研究正在进行患者1和患者2的产前随访，以确认确认 PGT-SR 周期、羊膜穿刺术和外周血分析结果之间的一致性。综上所述，研究团队证明了纳米孔测序准确检测BRT携带者易位断点的可行性。在临床PGT-SR周期中，纳米孔测序可用于区分无易位胚胎和平衡二倍体胚胎。该研究为BRT遗传咨询指南的完善提供了重要信息，未来有必要开展大规模的研究来验证纳米孔测序的特异性和敏感性。